Ileitis Monitor

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Die Ileitis - Die Labordiagnose

von Dr. Manfred Stein, 22.08.2004


Eine entscheidende Voraussetzung für eine erfolgreiche Kontrolle einer Erkrankung ist die richtige Diagnose der Ursache einer Leistungsminderung oder Diarrhoe in einer Gruppe erkrankter Schweine. Hierbei müssen alle differentialdiagnostisch in Betracht kommenden Ursachen abgeklärt werden, damit keine falschen Erwartungen an Therapie und/oder Prophylaxe gestellt werden. Bei Verdacht auf Ileitis ist das Ziel der Untersuchung nicht nur die Ursache der Erkrankung herauszufinden, sondern auch, den Infektionszeitpunkt zu bestimmen und daraus den optimalen Impfzeitpunkt abzuleiten.
Im Rahmen der Diagnosefindung müssen Proben der verdächtigen Schweine genommen und an ein veterinärmedizinisches Labor zur Untersuchung weitergeleitet werden. Im Falle der Ileitis sind Blutproben für den Nachweis von Serumantikörpern gegen Lawsonia intracellularis von zentraler Bedeutung. Kotproben dienen dem direkten Nachweis angefärbter Bakterien oder der DNA von Lawsonia intracellularis, eine routinemäßige Kultivierung dieses Erregers aus Kotproben ist nicht möglich.

Eine Sektion erkrankter Schweine muss unmittelbar nach der Euthanasie durchgeführt werden, um die typischen morphologischen Veränderungen der Ileitis sicher nachweisen zu können. Typische Darmläsionen lassen sich jedoch nur bei akut erkrankten Tieren finden. Liegt die Phase der Entzündung zum Sektionszeitpunkt bereits einige Wochen zurück, können typische Läsionen ausgeheilt sein. Im Rahmen der Diagnosefindung müssen parallel sämtliche Proben auch auf andere potenzielle Diarrhoeursachen untersucht werden. Sobald die endgültige Bestätigung der Diagnose vorliegt, können Impfungen oder andere Maßnahmen zur Kontrolle der Erkrankung im Betrieb eingeleitet werden.

Labordiagnose der Ileitis

Blutserologie zum Nachweis von Lawsonia intracellularis

Jüngste Entwicklungen der Biotechnologie haben die Herstellung von Lawsonia intracellularis-Antigen ermöglicht und die Verfügbarkeit spezifischer monoklonaler Antikörper verbessert. Immunfluoreszenz-Assays (IFA) oder Immunperoxidase-Assays (IPMA) stehen heute in zahlreichen Ländern weltweit zur routinemäßigen Analyse von Schweineserum auf Antikörper gegen Lawsonia intracellularis zur Verfügung. Ein kompetitiver Blocking-ELISA befindet sich im Entwicklungsstadium.

Immunfluoreszenz-Assay (IFA) für den Nachweis von Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis

Prinzip des Tests:

Kontinuierliche Zelllinien, infiziert mit Lawsonia intracellularis, werden auf 96er Mikrotiterplatten oder auf Testobjektträgern mit dem Antigensubstrat fixiert. Serumproben in einer Verdünnung von 1 zu 30 werden mit dem Antigensubstrat inkubiert, um positive oder negative Ergebnisse anzuzeigen. Zur Bestimmung der Antikörper können Serumverdünnungsreihen eingesetzt werden. Der Nachweis einer Bindung von spezifischen Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis an das Antigensubstrat erfolgt schließlich mit Hilfe eines mit fluoreszierendem Farbstoff konjugierten, anti-speziesspezifischen sekundären Antikörpers (z. B. Ziege-anti-Schwein-FITC-Konjugat). Drei positive Seren (hoch, mittel, niedrig) und ein negatives Serum dienen als Kontrollen.

Technische Ausstattung:

Die Beurteilung der Immunfluoreszenz erfolgt mit Hilfe eines UV-Lichtmikroskops. Bei Verwendung von 96er Mikrotiterplatten wird ein inverses Mikroskop eingesetzt.

Ergebnisformat:

Die Ergebnisse werden als positiv, negativ oder fraglich angegeben. Eine unspezifische Färbung gilt als negatives Resultat. Positive Reaktionen bei Verdünnungen = 1 zu 30 werden nach der Methode von Spaerman und Kaerber bestimmt. Verdünnungen < 1 zu 30 können zu unspezifischer Färbung führen, die keine eindeutige Interpretation zulässt.

Fotos 5.1.2 a-b: IFA zum Nachweis von Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis

Foto 5.1.2 a: Negatives Serum vom Schwein: Keine spezifische Immunfluoreszenz.



Foto 5.1.2 b: Serum eines Schweins post infectionem: Lawsonia intracellularis-spezifische Färbung. Lawsonia intracellularis sind intrazellulär (2.1), an den Zellmembranen (2.2), oder als nicht-zellassoziierte Bakterien (2.3) nachweisbar (160 x).

Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA) für den Nachweis von Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis.

Beim Immunperoxidase Monolayer Assay (IPMA) handelt es sich um ein ähnliches Verfahren wie beim IFA. Der sekundäre Anti-Spezies-Antikörper ist mit dem Enzym Peroxidase konjugiert, das gemeinsam mit einem Substrat eine braune, lichtmikroskopisch nachweisbare Verfärbung herbeiführt. Insgesamt entstehen weniger falsch-positive Resultate als beim IFA.

Kompetitiver ELISA (cELISA) für den Nachweis von Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis.

In naher Zukunft wird ein kompetitiver Blocking-ELISA verfügbar sein, der ein semiquantitatives Monitoring von Schweinebeständen mit hoher Durchlaufrate ermöglicht. Der Test kann mit Hilfe der Robotertechnologie automatisiert werden und die Daten lassen sich so auf objektiver Basis messen und analysieren. Dies führt zu einer verbesserten Wiederholbarkeit und Vergleichbarkeit der Analysen.

Prinzip des Tests:

Lawsonia intracellularis-Antigen wird durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper an die ELISA-Platte gebunden. Die gemäß dem Testprotokoll verdünnten Serumproben werden mit diesem Antigensubstrat inkubiert. Serumantikörper gegen Lawsonia intracellularis binden an das Antigen. Nach Entfernen des Serums wird der Kavität ein sekundärer, mit Peroxidase konjugierter monoklonaler Antikörper zugesetzt, der an ein anderes Epitop von Lawsonia intracellularis bindet. Bei Anwesenheit von Schweine-Antikörpern, die zuvor an das Antigensubstrat gebunden haben, sind keine oder weniger Bindungsstellen für den sekundären monoklonalen Antikörper verfügbar, was zu einer insgesamt reduzierten Bindung führt (Hemmung). Nachdem die Inkubation mit einem Substrat gestoppt wurde, ergibt die Bindung des konjugierten monoklonalen Antikörpers eine gelbe Färbung, deren Intensität photometrisch gemessen wird. Als 100 %-Referenz dienen Kavitäten, die ohne Zusatz von Schweineserum inkubiert wurden. Ein positives Schweineserum und ein negatives Serum dienen als Kontrollen.

Technische Ausstattung:

Die Messung der Extinktion der einzelnen Kavitäten der Mikrotiterplatte erfolgt mit Hilfe eines Photometers mit 450 nm-Filter.

Ergebnisformat:

Die Testergebnisse werden mit Hilfe der 100 %-Referenzprobe nach folgender Formel berechnet: 100 - (Extinktion Testserum / Extinktion 100%-Referenz) x 100 als prozentuale Hemmung (PI). PI-Werte werden gemäß der Anleitung des Herstellers als positiv, fraglich oder negativ interpretiert. Für detaillierte Analysen können die PI-Werte individueller Seren graphisch dargestellt und für die Prozesskontrolle oder die kontinuierliche Prozessverbesserung mit Hilfe statistischer Methoden ausgewertet werden.

Tabelle: Vor- und Nachteile serologischer Tests zum Nachweis von Lawsonia intracellularis

Serologische Assays haben den Vorteil, dass sie relativ preiswert und bei hoher Spezifität sehr einfach durchzuführen sind. Ein Nachteil ist die Tatsache, dass sie bei positivem Ergebnis lediglich eine früher stattgefundene Exposition des betroffenen Schweines mit dem Krankheitserreger (Lawsonia intracellularis) anzeigen, jedoch keine Aussage darüber zulassen, ob das Tier am Tag der Untersuchung akut infiziert ist.

Impfantikörper können mit Hilfe der gängigen serologischen Assays nicht von natürlichen Antikörpern einer Feldinfektion unterschieden werden. Zudem kann die Impfung während des Aufbaus der schützenden Immunität die Bildung von Antikörpern geringer Nachweisbarkeit stimulieren.

Nachweis von Lawsonia intracellularis-Antigen oder -DNA

Lawsonia intracellularis lässt sich nur sehr schwer isolieren und in Zellkulturen kultivieren. Die Diagnose beschränkt sich deshalb auf den direkten Nachweis des Erregers mit Hilfe der Silberfärbung oder, noch spezifischer, durch Verwendung von FITC- oder Peroxidase-konjugierten, polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen Lawsonia intracellularis. Diese Methoden werden jedoch nur bei post-mortem-Proben eingesetzt. Der Nachweis genomischer DNA von Lawsonia intracellularis durch eine einfache oder zweifache ("nested") Polymerase Kettenreaktion (PCR oder nPCR) ist ein erwiesenermaßen hoch sensitives und hoch spezifisches Testverfahren. Diese Methode kann sowohl an post-mortem-Proben als auch an Kotproben lebender Schweine durchgeführt werden. Problematisch ist, dass die Ausscheidung von Lawsonia intracellularis über den Kot nicht konstant erfolgt. In der Regel lässt sich der Erreger bereits kurz nach der Infektion, also unter Umständen noch deutlich vor der Serokonversion, im Kot nachweisen. Im weiteren Verlauf wird die fäkale Ausscheidung zunehmend geringer und tendenziell intermittierend. Die Kotproben (1-2 g oder 1-2 Kottupferproben) werden direkt vom einzelnen Tier entnommen. Sammelproben für die PCR reduzieren zwar die Kosten, sie verringern aber auch die Sensitivität des Tests.

PCR-Analyse von Schweinekot zum Nachweis von Lawsonia intracellularis

Heute stehen äußerst sensitive und spezifische PCR-Assays zur Verfügung. Diese Tests arbeiten mit Primerpaaren, die von verschiedenen Abschnitten der DNA-Sequenz von porzinen Lawsonia intracellularis stammen. Das PCR-Verfahren an Kotproben verlangt ein präzises und detailgetreues Befolgen der richtigen Extraktionsmethoden, um sicherzustellen, dass die als Matrize für die PCR verwendete bakterielle DNA frei von inhibitorischen Substanzen ist. Der Vorteil der PCR gegenüber serologischen Tests liegt in erster Linie darin, dass bestimmt werden kann, ob ein Schwein zum Zeitpunkt der Untersuchung unter einer aktiven Infektion leidet. Nachteile sind die höheren Kosten und die geringe Sensitivität bei subklinischen und chronischen Formen der Erkrankung.

Prinzip des Tests:

Die DNA des Erregers wird aus Kotproben oder Organmaterial extrahiert. Durch die heute kommerziell erhältlichen DNA-Präparationskits verbessern sich in der Regel die Qualität und die Reproduzierbarkeit der DNA-Extraktion. Vor der Weiterverarbeitung kann DNA bei -20 °C gelagert werden. Zur Amplifikation von Genomfragmenten werden Lawsonia intracellularis-spezifische Primersets verwendet. Diese werden schließlich in einer realtime-PCR durch markierte Primer oder in einer Agarosegel-Elektrophorese durch DNA-Färbung (z.B. Ethidiumbromid) sichtbar gemacht. Falsch-positive Resultate entstehen durch eine Kontamination des diagnostischen Materials während der Probenentnahme, beim Transport oder bei der Weiterverarbeitung, aber auch infolge einer Kreuzkontamination während der Amplifikation. Das Risiko einer Kreuzkontamination liegt bei der 100 bis 1000mal sensitiveren zweifachen, nested PCR signifikant höher als bei der gewöhnlichen, einfachen PCR. Das PCR-Verfahren sollte ausschließlich in Labors durchgeführt werden, die ausreichend Erfahrung mit dieser Methode haben und in der Lage sind, große Probenmengen für die molekularbiologische Diagnose zu verarbeiten.

Technische Ausstattung:

Für das PCR-Verfahren werden Zentrifugen für die DNS-Präparation, Heizblocks und Thermocycler benötigt. Sehr zu empfehlen sind strikt getrennte Räumlichkeiten für die verschiedenen Schritte der PCR oder eine Ausrüstung, die Kreuzkontaminationen vermeidet. Dies gilt insbesondere für die nested PCR.

Ergebnisformat::

Der Nachweis von Lawsonia intracellularis-spezifischen PCR-Produkten in der realtime-PCR oder von Fragmenten entsprechender Größe bei der Gel-elektrophorese gilt als positives Resultat. Ein positives Ergebnis besagt also lediglich, dass DNA von Lawsonia intracellularis nachgewiesen wurde. Es bedeutet jedoch nicht notwendigerweise, dass der Erreger immer noch lebt und sich repliziert. Allerdings zeigen mRNA-Assays, dass positive PCR-Resultate von infizierten Tieren in der Regel auch mit einer entsprechenden Infektiosität einhergehen.

Zu beachten ist, dass Impf-DNA von Feld-DNA mit Hilfe der gegenwärtig verfügbaren PCR-Assays nicht unterschieden werden kann.

Foto 5.1.6 a: Zweifache (nested) PCR (nPCR) für den Nachweis von Lawsonia intracellularis

Foto 5.1.6 a: PCR-Analyse mit Hilfe der nested PCR:

  • Bahn 1 u. 8: Molekulargewichtsmarker.
  • Bahn 2: Lawsonia intracellularis-DNA-Negativkontrolle
  • Bahn 3: Lawsonia intracellularis-spezifische Positivkontrolle (270 bp)
  • Bahn 4: DNA aus der Kotprobe: Negativ für Lawsonia intracellularis
  • Bahn 5: Ileum Schwein: Negativ für Lawsonia intracellularis
  • Bahn 6: DNA aus der Kotprobe: Positiv für Lawsonia intracellularis
  • Bahn 7: Ileum Schwein: Positiv für Lawsonia intracellularis


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